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혈액 내 극미량으로 존재하는 암세포를 효율적으로 분리하는 기술이 개발됐다. 이를 활용하면 전이암의 조기 진단은 물론 환자맞춤형 암 치료가 가능해진다. UNIST(총장 정무영) 생명과학부의 조윤경 교수(IBS 첨단연성물질연구단 그룹리더)가 이끄는 공동 연구진은 암 조직에서 떨어져 나와 혈관 내를 순환하는 종양세포(CTC)를 선택적으로 분리할 수 있는 기술을 개발했다. 이 기술은 미국화학회에서 발행하는 분석 분야의 세계적 학술지 ‘분석화학(Analytical Chemistry)’ 최신호 표지로 게재됐다. CTC는 암 조직에서 떨어져 나와 핏속에서 떠다니는 종양세포다. 이들이 다른 조직에 부착하면 전이암이 발생하게 된다. 이 세포를 미리 찾아내면 전이암을 조기에 발견할 수 있지만, 혈액 1㎖ 속 CTC는 수십 개 미만으로 매우 적어 검출하기 어렵다. 같은 양의 혈액 속에 적혈구는 수십억 개, 백혈구는 수백만 개 존재하는 것과 대조적이다. 조윤경 교수팀은 ‘FAST(Fluid Assisted Separation Technology)’ 기술을 랩온어디스크(Lab-on-a-disc)에 적용해 수㎖의 혈액에서 1분 내에 CTC를 95% 이상의 효율로 포획할 수 있는 방법을 개발했다. 랩온어디스크에 마이크로 필터를 장착시켜 크기 차이로 세포를 분리하는 방식이다. FAST 랩온어디스크 위쪽으로 혈액을 넣은 뒤, 구동장치에 넣고 회전시키면 크기가 작은 혈구세포가 필터 아래쪽으로 빠져나가고 CTC만 남는다. 필터는 랩온어디스크 가운데에 들어가는데 혈액이 걸러지는 아래쪽에는 항상 물이 채워진다. 채워진 물이 ‘마중물’ 역할을 해, 혈액이 필터 전면에서 고르게 걸러지므로, CTC가 손상되는 것도 막는다. 기존 CTC 검출은 혈액에 복잡한 전처리 과정을 해야 하고, 비싼 시료도 필요했다. 또 CTC 표면에 있는 단백질을 이용하는 방식은 정확도 부분에서 한계가 있었다. 필터로 CTC를 걸러내는 기술도 있었지만 필터가 자주 막혀 분리 효율이 떨어진다는 문제점이 있었다. 이번 논문의 공동 제1저자인 임민지 UNIST 생명과학부 석‧박사통합과정 연구원은 “FAST 랩온어디스크는 원심력 기반 유체제어기술을 활용해 세포들을 부드럽고 효율적으로 분리할 수 있다”며 “마중물이 필터를 한 차례 적셔주기 때문에 필터 전체를 효율적으로 쓸 수 있기 때문”이라고 설명했다. 그는 또 “혈구세포와 CTC를 분리하는 시간이나 효율 등의 성능은 세계 최고 수준”이라고 강조했다. 연구진은 이 기술을 이용해 142명의 다양한 암환자와 50명의 정상인의 혈액 검사를 진행해 CTC 검출 성능을 검증했다. 특히 폐암환자의 혈액에서 분리한 CTC에서 조직검사 때와 동일한 유전정보도 확인할 수 있었다. 앞으로 분자진단이나 맞춤형 진료에 이 기술을 활용 가능하다는 걸 보여준다. 조윤경 교수는 “소형 장비를 활용하고 사용법이 매우 간단하기 때문에 병원에서 직접 사용할 수 있는 편리한 기술”이라며 “조직 검사가 아닌 채혈만으로 암세포를 검출할 수 있어 향후 전이암의 조기 진단이나 항암치료 효과의 모니터링 등 암의 진단과 치료에 유용할 것”이라고 전망했다. 이번 연구는 부산대학교병원(PNUH)의 박도윤 교수팀과 공동으로 진행됐다. 연구 지원은 보건복지부의 임상현장 발굴 국가핵심 중개연구 사업과 기초과학연구원(IBS) 첨단연성물질연구단을 통해 이뤄졌다. 또 해당 기술은 국내 벤처 기업 ㈜클리노믹스에 기술이전돼 사업화됐다.
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[붙임] 연구결과 개요 |
1. 연구배경암은 인류의 사망원인 중 1위를 차지하는 질병이며, 꾸준히 인류의 삶을 위협하고 있다. 암환자 중 90% 이상은 원발암이 아닌 ‘전이암’으로 사망한다. 전이가 일어나는 동안 혈액순환 종양세포(Circulating Tumor Cell; CTC)가 원발암에서 떨어져 나와 혈관 내로 침입하게 되고, 혈류와 함께 순환하다가 다른 조직에 침투해 전이암을 만들게 된다. 현재 암 진단은 ‘조직검사(Tissue biopsy)’를 통해 이뤄진다. 이 방식은 환자의 고통이 크고, 감염을 통한 2차 질환 유발의 위험성이 존재한다. 무엇보다도 주기적으로 조직검사를 수행하기 힘들다는 문제점이 있다. 이런 문제점을 해결하기 위해 혈액, 소변, 침 등의 생체 유체를 활용하는 ‘액상 조직검사법(Liquid biopsy)’이 대두되고 있다. 특히 혈액에 존재하며, 암 전이에 핵심 역할을 하는 CTC에 대한 연구가 크게 주목 받고 있다. CTC는 혈액 1㎖에 수십 개 미만으로 존재하며, 이를 수십억 개의 다른 혈구 세포에서 분리해내는 정밀한 기술이 필요하다. 기존 연구에서는 CTC 표면에 특이적으로 존재하는 단백질을 활용해 면역친화도(immunoaffinity)를 바탕으로 CTC를 분리했다. 하지만 분리 전 복잡한 샘플 준비 단계가 필요하고, 2~4시간 이상으로 오랜 분리 시간이 요구된다. 또 암세포마다 표면 단백질 발현량이 균일하지 않아 발현량이 낮은 세포는 분리 효율이 떨어지는 문제점이 있었다. |
2. 연구내용본 연구에서는 세포의 크기 차이를 이용해 CTC를 고효율로 분리할 수 있는 원심력 기반의 ‘미세유체 제어기술(Fluid assisted separation technology: FAST)’을 개발 했다. 또 이 기술을 이용해 샘플 전처리 과정을 거치지 않은 전혈(whole blood)을 활용해 1분 이내에 CTC를 분리했다. CTC는 백혈구나 적혈구 등의 혈구세포보다 크다고 알려졌다. 이런 특징을 활용해 마이크로 필터로 혈액을 여과해 CTC를 분리했다. 기존에도 크기를 활용한 CTC 분리 연구 사례들이 있었다. 그러나 대부분 진공 기반의 음압을 활용한 여과를 수행 했다. 이 경우에는 여과막(membrane)의 기공 출구에서 공기-액체의 경계면이 발생하게 되고, 액체가 여과막 기공을 통과하기 위해서는 모세관 압력을 극복해야 한다. 일정 부분에서 모세관 압력을 극복해 여과가 이뤄진다고 해도, 해당 부분으로만 여과가 진행된다. 이처럼 전면적이 아닌 일부 면적에서만 이뤄지는 불균일한 여과는 여과막을 자주 막히게 해 높은 압력 차이로 인한 세포 손상 등의 우려가 있었다. 이번 연구에서는 막의 뒷면에 마중물을 채우고, 여과 도중에도 마중물이 빠져나가지 않도록 원심력 기반의 미세유체제어기술(FAST)을 개발했다. 이 장치에서는 원심분리를 하는 동안 혈액이 필터의 기공을 통해 흘러가면서 막의 뒷면에 있는 마중물과 만난다. 이렇게 되면 막의 전면적에서 균일한 유체의 흐름이 조성되고 여과막도 균일하게 여과에 활용된다. 이로 인해 3㎖의 전혈에서 막힘 현상 없이 1분 이내에 CTC를 포획할 수 있었으며, 여과에 필요한 압력을 최소화해 살아있는 세포의 포획도 가능했다. FAST 기술을 활용해 전혈에서 CTC를 분리할 경우 포획 효율은 95% 이상 확보할 수 있었다. 유방암, 폐암, 소화기암 등의 실제 암환자 샘플에서 CTC를 검출(0-540 CTCs/7.5㎖)할 수 있다는 사실도 확인했다. 상용화된 CTC 분리 제품과 비교해 암환자 혈액에서 CTC 검출은 1.5배 이상 늘었으며, 분자 진단을 방해하는 백혈구 오염은 6.0배 이상 줄일 수 있었다. 특히 폐암 환자에서 분리된 CTC에서는 조직검사에서 검출한 것과 일치하는 돌연변이 유전자 정보를 검출할 수 있었다. |
3. 기대효과이번 연구를 통해 액상 조직검사 기반 암 진단의 대표적 마커인 CTC를 혈액에서 고효율로 분리할 수 있는 기술과 장비를 개발했다. 이 방식은 자주 시행할 수 없고 환자에게 부담되는 기존의 조직검사의 단점을 극복하고, 단지 채혈만으로 암세포를 검출할 수 있다. 이 덕분에 주기적으로 암에 대한 검사가 가능해 전이암의 조기 진단이나 항암 효과의 모니터링, 예후 예측 등에 활용될 수 있다. 또한 분리된 CTC에서 암 조직에 존재하는 유전정보와 일치하는 유전정보를 확인함으로써, 유전자 돌연변이 검사를 기반으로 하는 개인 맞춤형 항암치료에 활용할 수 있다. 이 점을 이용하면 암환자에 적합한 치료방법 선정 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. |
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[붙임] 용어설명 |
1. 분석화학(Analytical Chemistry)ACS 출판그룹에서 발행하는 분석 분야의 세계 최고 권위의 학술지. (Impact factor: 5.886, 분석화학 분야 ranking: 4/75) |
2. 혈액순환 종양세포(Circulating Tumor Cell: CTC)원발암에서 떨어져 나와 혈관 내로 침입해 혈류와 함께 순환하는 종양세포를 말한다. 혈관 내에서 다른 혈구들과 순환하다가 다른 조직의 혈관에 부착되면 그 조직에 침투해 전이암 조직을 만든다고 알려져 있다. |
3. 조직 검사(Tissue biopsy)생체에서 조직 일부분을 떼어내 현미경 검사를 수행하고, 이미지를 통한 병리학적 해석을 수반하는 가장 표준적인 암 진단 방법을 말한다. 조직 부위에 따라서는 불가능한 암 종류도 있으며 조기진단이나 치료 이후의 예후에 활용하기 어려운 문제점이 있다. |
4. 액상 조직검사(Liquid biopsy)혈액, 소변, 침 등의 생체 유체를 활용해 질병을 진단하는 방법이다. 각종 생체 유체에 존재하는 세포, 소포체, DNA 등을 분리정제하고 이를 바탕으로 질병 정보를 획득하는 방식이다. 주기적으로 진단할 수 있어 질병을 효율적으로 치료할 수 있도록 돕는다. |
5. 랩온어디스크(Lab-on-a-disc)디스크 모양의 칩에 미세구조들이 일체화돼 각종 생화학 반응을 자동으로 수행할 수 있는 바이오칩의 한 종류다. 칩을 모터에 장착해 회전에 의해 발생하는 원심력을 통해 미세유체 흐름 조절이 가능하다. 이를 통해 복잡하고 비싼 구동 장비 없이도 각종 생화학 반응을 전자동화으로 수행 가능하다. |
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[붙임] 그림설명 |
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그림1. 저널 표지로 활용된 FAST 기술. 혈액순환 종양세포를 찾아내는 FAST 기술이 적용된 디스크를 이용해 혈액에서 CTC를 분리하는 모습을 보여주고 있다.
그림 2. FAST 디스크의 디자인과 기능. (a)non-FAST의 경우 혈액 샘플이 필터의 기공을 통과할 때 기체-액체 경계면이 형성되며, 모세관 압력(Pc)보다 큰 압력(P)이 가해졌을 때만 여과할 수 있다. 일정 부분을 통해 여과가 시작되면 해당 부분으로만 여과가 이뤄진다. 원심력 기반의 시스템에서는 필터의 바깥쪽 부분에서 주로 여과가 이뤄진다. FAST의 경우 혈액 샘플이 필터의 기공에 채워진 마중물과 만나 낮은 압력에서도 여과가 가능하다. 필터 아랫면의 마중물이 전체 여과 과정 동안 빠져나가지 않고 유지되면서 전면적에서의 균일한 흐름과 여과를 유도한다. 10㎛ 붉은 형광 비드로 여과한 결과로 해당 사실이 증명 됐다. (위쪽 그림: non-FAST, 아래쪽 그림: FAST 방법, scale bar: 100㎛) (b) FAST가 적용된 랩온어디스크와 휴대용 구동기기의 이미지. 8㎛ 지름의 기공을 갖는 track-etched polycarbonate 필터가 CTC 분리에 이용된다. 디스크 구동 사진은 CTC 분리 전 과정을 보여준다. (i, ii)전혈 분리, (iii)세척, (iv)면역 염색 등의 과정이 모두 디스크 안에서 이뤄진다. 파란색 화살표는 필터 아래쪽의 마중물의 메니스커스(meniscus) 위치를 가리킨다.
그림 3. FAST를 활용한 압력차, 여과 시간, 전혈에서 암세포 회수율 측정 결과 (a) 전혈에서 CTC를 분리하기 위해 디스크가 600RPM으로 회전하는 동안 필터 입구와 출구에서 발생하는 압력 차이를 측정할 수 있는 무선 압력 측정시스템의 모식도와 사진이다. 무선 압력 센서는 데이터 획득 보드와 연결돼 있으며, 획득한 데이터를 블루투스 모듈을 통해 컴퓨터로 전달한다. (b)압력차와 (c)여과 부피를 전혈 여과 과정 동안 측정했다. FAST 디스크를 쓰면 낮은 압력차(~1kPa)에서 신속한 CTC 분리가 가능하다.(20초 이하, 3㎖ 전혈 분리). (d) MCF-7 유방암 세포를 전혈에 심어서(spike) 회수율을 측정했을 때, non-FAST 경우 54%의 회수율을 보였으나, FAST 디스크는 95%의 높은 회수율을 보였다.
그림 4. non-FAST와 FAST의 수치해석상 비교. (a) 600RPM으로 디스크를 회전시킬 때 0.13초에서 non-FAST(위쪽 그림)와 FAST(아래쪽 그림) 각각의 모드에서 혈액 흐름(왼쪽 그림)과 압력 분포(오른쪽 그림)를 보여주는 시뮬레이션 결과. non-FAST의 경우 위쪽 챔버에서 압력구배가 생기고, 혈액의 흐름이 필터의 바깥쪽으로 집중된다. 이 현상으로 필터의 분리 효율을 저하시킨다. 반면 FAST 디스크의 경우 필터의 아래 챔버가 마중물로 채워진 상태가 분리 과정 동안 유지되기 때문에 혈액 분리가 전체 필터에서 균일하게 일어나고, 전면적을 효율적으로 사용 가능하기 때문에 막힘 문제를 완화시킬 수 있다. (b) 그림 3(a)에서 표시된 필터 위 (1)와 아래 (2)에서의 압력변화 및 (c) 압력 차이 (∆p=p1-p2)를 보여주는 그래프
그림 5. 전혈에 spike한 암세포주를 이용한 FAST 디스크 구동조건 최적화. MCF-7 세포(30~100cells)를 전혈에 섞어서 다양한 (a)회전 속도와 (b)세척 횟수에 따른 회수율과 순도를 측정했다. 600RPM 회전속도와 두 번의 세척이 회수율과 순도를 고려했을 때 최적 조건으로 선정돼 이후 실험에 적용됐다. 분자 진단의 경우, 높은 순도 (>3.0-log depletion of WBCs)를 필요로 해 6번의 세척이 사용됐다. 회수율(빨간 글씨, capture efficiency)은 디스크를 이용해 분리한 암세포 개수/주입한 전체 암세포 개수로 정의하며, 순도(파란 글씨, log depletion of WBC)는 log [주입한 전체 백혈구 개수/멤브레인 위에 남은 백혈구 개수]로 정의한다. (c) FAST 디스크를 사용해 다양한 EpCAM 발현량과 셀 크기를 갖는 5종의 암세포주를 이용해 각각 회수율을 테스트 했을 때, 암 종류에 상관없이 96% 이상의 회수율을 얻었다. (d) 재현성 확인을 위해 15일 동안 30개의 디스크를 사용해 암세포(10~100cells)를 섞어 실험한 결과 96.2±2.6%의 회수율을 얻었다. (e) FAST 디스크를 이용해 분리한 암세포(AGS)를 15일 동안 배양 후 살아 있는 것과 죽은 것을 비교한 결과 높은 생존율을 보였다. Scale bar: 100㎛.
그림 6. 상용화된 크기 기반 CTC 분리 장치와 성능 비교 및 FAST 디스크를 이용한 임상 샘플 테스트. (a) MCF-7 세포(30~100개)를 섞은 혈액 샘플을 이용해 FAST 디스크와 ScreenCell에서 각각의 회수율과 순도 측정. FAST 디스크의 경우 전혈을 사용하고 원심력을 이용해 8㎛ 필터로 샘플을 여과했고, ScreenCell의 경우 권장 프로토콜대로 실험 전 혈액을 전처리(prefix/dilution) 하고 진공 튜브의 음압을 이용해 7.5㎛ 멤브레인으로 여과를 진행했다. (b) 면역염색을 통한 환자 유래 CTC 형광 염색 이미지. CTC 특이 마커인 EpCAM과 CK로 염색되고, DAPI로 핵이 염색된 세포를 확인했다. (Scale bar: 8㎛). (c) 임상 샘플을 이용한 FAST 디스크와 ScreenCell의 성능비교: 유방암 3건, 위암 4건, 대장암 4건, 담관암 3건, 폐암 2건. 모든 CTC 개수는 7.5㎖로 표준화했다. (d) FAST 디스크를 이용해 임상 샘플에서 CTC를 분리한 결과. 총 정상인(H) 50건, 유방암(B) 18건, 폐암(Lu) 35건, 위암(S) 76건, 담관암(BD) 3건, 담낭암(GB) 4건, 간암(Li) 3건, 췌장암(Pa) 3건을 시험했다. 암 종류에 관계 없이 암환자들에게서 정상인 대비 유의한 개수의 CTC가 분리됐다. (e) 폐암 환자 중 전이 유무에 따른 CTC 카운트 결과. 정상인과 폐암 환자 사이에 유의한 차이가 있으며, 전이 유무에 따라서도 유의한 차이가 있음을 확인했다. (f) 폐암 환자 유래 CTC의 돌연변이 검출 결과. EGFR real-time PCR을 통해 폐암 환자 유래 CTC에서 L858R과 19-Del 돌연변이를 검출했다. 파란색 선은 internal control을 가리키고 빨간색 선은 target sample을 가리킨다. |
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