^*간섭: 빛은 입자의 성질도 있지만 파동의 성질도 있다. 간섭은 파장이 서로 상쇄되거나 보강되는 현상. 파도나 동심원이 다른 파도나 동심원과 만나면 그 모양이 바뀌는 현상이 대표적 간섭현상이다.

^*고해상도 광학현미경: 2014년 노벨상을 수상한 STED, SMLM과 같이 아베의 회절한계(diffraction limit)를 뛰어넘는 광학현미경.

^*평면파: 넓은 영역을 한꺼번에 취득할 수 있는 파형. 이 실험에서 진폭의 변화를 없애면 평면파가 된다.

^*정현파: 어둡고 밝은 부분이 존재하는 줄무늬 빛. 어둡고 밝음의 경계가 뚜렷하지 않고 사인함수와 같이 부드럽게 이어져 있다.

[붙임] 연구결과 개요

1. 연구배경

현미경 대물렌즈의 공간 분해능이 높을수록 취득하는 이미지의 해상도가 개선되어 더 자세한 구조의 관찰이 가능하다. 하지만 단순히 배율이 높은 렌즈를 사용해서 상을 확대할수록 관측 대상의 미세구조가 더 선명하게 보이게 되는 것은 아니다. 일반적인 광학현미경은 가시광선을 이용해 물질을 관찰하기 때문에, 공간 분해능의 한계(회절 한계, Diffraction limit)1)가 존재하기 때문이다. 개구수(Numerical aperture)2)가 큰 렌즈를 사용하거나 가시광선보다 짧은 파장의 빛(자외선, 전자빔)을 조사하면 높은 공간 분해능을 얻을 수 있지만, 렌즈의 개구수를 키우는 데는 물리적인 한계가 존재하고, 짧은 파장의 빛을 사용하는 측정 방법은 가시광선 영역대의 광학 현미경보다 구현하기 훨씬 더 복잡하고 시료 준비가 까다롭다. 무엇보다 짧은 파장의 빛은 높은 에너지가 살아있는 세포를 손상시켜 있는 그대로 세포를 관찰이 어렵다는 점에서 광학현미경을 대체할 수 없다.

1990년대에 들어 회절 한계를 극복하기 위한 가시광선 대역의 파장을 이용한 초고해상도 형광 광학현미경 (Fluorescent microscope)3)들이 개발됐다. 형광 광학현미경에도 회절 한계가 적용되어 공간 분해능의 한계가 존재하고, 이를 극복하기 위해 초고해상도 (Super-resolution) 현미경이 개발되었다. 2014년에 노벨화학상을 받은 유도방출감쇄 (Stimulated emission depletion, STED) 현미경4)과 단일 형광분자 위치기반 현미경 (Single molecular localization microscopy, SMLM)5)이 대표적이다. 하지만 STED, SMLM은 특수한 형광 염색이 필요하다는 점, 광손상 (photodamage, 강한 빛에 의한 손상)과 광퇴색 (photobleaching, 형광염색이 바래지는 현상)의 영향이 크거나 (STED), 일반적인 widefield 이미징6) 방법보다 측정 시간이 현저하게 오래 걸린다는 단점 (SMLM) 때문에 살아있는 세포의 실시간 이미징에는 적용이 어렵다.

2. 연구내용

구조화 조명 현미경 (Structured Illumination Microcopy, SIM)은 STED나 SMLM에 비해 광손상이 적고 시간 분해능이 좋다. 하지만 여전히 초고해상도 기술을 도입해 공간 분해능을 높이면 이미지 전체에서 시간 분해능이 저하된다는 문제가 있다. 본 연구에서는 현재까지 당연하게 생각되었던 근본 개념(렌즈를 이용해 사진을 찍으면 사진 전체가 해당 렌즈에 의해 정해지는 동일한 영상 품질을 갖는다는)을 뒤엎을 수 있는 광학 시스템을 제안하고 이를 구현하였다.

Gustafsson 박사가 발명한 SIM은 무아레 패턴(Moiré patterns)을 응용한 현미경이다. 두 장의 방충망을 겹쳐서 회전시키면, 방충망의 미세한 구조보다 훨씬 더 큰 간섭무늬가 관찰되는데 이러한 큰 간섭무늬를 무아레 패턴이라 한다. 이러한 원리로 발생하는 간섭무늬와 겹쳐진 미세한 패턴 중 하나의 구조 정보를 알고 있다면 나머지 하나의 미세한 패턴의 구조도 수학적으로 계산이 가능하다. 회절 한계에 해당하는 주기를 가진 정현파 형태의 빛을 조사하여 취득한 이미지는, 조사한 빛의 패턴과 관찰 대상의 미세한 구조가 혼재하는 무아레 패턴으로 생각할 수 있다. 여기에서 정현파 패턴의 위상을 변화시켜서 상대적인 위상차를 부여하고, 이렇게 얻은 복수의 이미지로부터 정현파 패턴의 주파수와 위상 정보를 추출하여 이미지를 재구성함으로써 일반 현미경의 해상도의 2배에 해당하는 초고해상도 정보를 얻는 현미경 기술이 SIM이다.

다른 초고해상도 이미징 기술과 비교했을 때, SIM은 뛰어난 시간 분해능을 지니고 있지만, 여전히 한 장의 초고해상도 이미지를 재구성하기 위해서는 통상적으로 9장 (2D) 또는 15장 (3D)의 이미지가 있어야 한다. 이처럼 현존하는 모든 광학 영상 기술들에서는, 공간 분해능을 향상시키면 시간 분해능의 저하가 발생하고, 시간 분해능을 향상하기 위해서는 공간 분해능의 희생이 불가피하다는 한계가 존재한다. SIM 영상을 얻기 위해서는 다수의 이미지로부터 초고해상도 정보를 추출해야 하기 때문에, 초고해상도 이미지 구성에 필요한 영상 장수만큼 시간 분해능이 저하 된다. 따라서 초고해상도로 관찰해야 하는 미세한 구조를 가진 영역과 빠른 속도로 움직이는 관측 대상이 포함된 영역이 공존하는 경우, 일반 해상도로 빠르게 움직이는 대상을 측정하거나 초고해상도로 미세한 구조를 가진 영역을 관측하는 것은 가능하지만, 동시에 측정하는 것은 현재까지 기술로는 불가능하다.

본 연구에서는, 한 장의 이미지 내에서 조사되는 빛의 진폭을 공간적으로 다르게 제어하여 공간 분해능과 시간 분해능을 향상하는 영역을 나누어 동시에 측정한 결과를 세계 최초로 보고했다. 평면파(Plane wave)7)를 조사해 시간 분해능이 강화된 영역은 widefield imaging과 동등한 시간 분해능으로 미세 유로 채널 내에 생성되는 유체의 흐름을 측정할 수 있다. 반면 정현파(Sine wave)8)를 조사한 영역은 공간 분해능을 높일 수 있기 때문에, 유체의 흐름으로 유발되는 세포 미세구조의 변화를 초고해상도 이미지로 얻을 수 있다.

3. 기대효과

현존하는 현미경으로는 관측 불가능했던 서로 다른 시공간 스케일의 생명현상을 동일 시스템에서 한 이미지 내에 동시에 측정 가능하게 했다. 지금껏 시공간 분해능 중 어느 한쪽을 희생시켜야만 했던 상쇄 효과를 제거하고, 필요에 따라 이미지 내의 다른 영역에 초고해상도·초고속 이미지를 적용할 수 있어, 미세 유로 채널 관련 연구나 높은 시간 분해능을 요구하는 칼슘 신호 전달 등의 생명·물리 현상의 관측이 필요한 연구 분야에 파급효과가 있을 것으로 기대할 수 있다.

이에 더하여 10 kHz 이상의 빠른 속도로 빛의 진폭을 공간적으로 제어 가능한 광학 시스템을 기반으로 하고 있으므로, 초고속 이미징 시스템의 구현이 가능하다. 수백 Hz의 sCMOS 카메라로 이미징할 경우를 가정하면, 한 장의 이미지를 취득하는 동안 조사하는 빛의 진폭을 ON/OFF 상태로 제어하여 순간순간의 측정 대상의 형태와 위치를 측정함으로써 두 기기의 속도의 곱에 해당하는 수 MHz에 해당하는 초고속 이미징이 가능하다. 촬영속도와 내장메모리의 크기로 결정되는 현존하는 초고속 이미징 카메라의 최대 이미징 가능 시간을 대폭 향상 시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한 조사하는 빛의 진폭 패턴을 다양하게 제어함으로써, optical sectioning SIM, 전반사형광현미경, tomography 등의 폭넓은 확장성을 지니고 있다.

[붙임] 용어설명

1.회절 한계 (Diffraction limit)

빛의 파동성을 보여주는 현상 중 하나가 회절이다. 직진하던 빛이 좁은 틈을 통과한 후 일정 범위로 넓게 돌아 진행하는 것이 그 예다. 아주 작은 점광원을 렌즈를 통해서 관찰할 때, 렌즈를 통과하면서 빛이 회절돼 실제 크기인 점으로 보이지 않고 넓게 퍼져 보이게 된다. 모든 광학 시스템에는 이러한 회절 현상 때문에 생기는 공간 분해능의 한계가 존재하는데 이를 회절 한계라 부른다. 일반적인 광학현미경은 회절한계로 인해 0.2마이크로미터(가시광선 최단 파장의 1/2길이)보다 더 작은 물체를 식별할 수 없다.

 2.개구수 (Numerical aperture)

렌즈의 공간 분해능을 계산하기 위한 지표로, 개구수가 클수록 높은 해상도의 이미지를 취득할 수 있다. 개구수는 측정 대상으로부터 대물렌즈에 입사하는 빛의 광축을 기준으로 대물렌즈로 입사 가능한 빛의 최대 각도의 사인 값과, 측정 대상과 대물렌즈 사이의 매질의 굴절률의 곱으로 정의된다.

3.형광 광학현미경 (Fluorescent microscope)

세포는 투명하므로 단순히 빛을 비춰 현미경의 대물렌즈만으로는 관찰이 어렵다. 따라서 원하는 부위에 특정 파장대의 빛을 조사하면 형광이 발현되는 물질을 세포 표지해 발생하는 형광 신호를 취득하는 형태로 세포를 관찰하는데 이를 형광 현미경이라 한다. 

4.유도방출감쇄 (Stimulated emission depletion, STED) 현미경

2014년 노벨 화학상을 수상한 형광 광학현미경의 한 종류. 서로 다른 파장대의 두 빛에 의해 ON/OFF 상태가 제어 가능한 형광 물질을 이용한다. 형광을 ‘ON’ 상태로 만드는 파장에 해당하는 빛으로 회절 한계에 해당하는 크기의 초점을 생성하고, 초점 주위에 형광을 ‘OFF’ 상태로 만드는 파장의 빛을 도넛 모양으로 조사함으로써, 회절 한계보다 더 작은 초점에 해당하는 영역에서만 방출되는 형광 신호를 취득할 수 있다. 이렇게 형성된 초점으로 관측 대상을 스캔(scan)한 뒤 이를 합쳐서 하나의 이미지를 구성하는 스캐닝 기반 현미경이다. 반면 SIM은 넓은 영역을 한 번에 카메라로 취득한 이미지 즉 와이드 필드(Widefield) 기반 현미경이다.  

5.단일 형광분자 위치기반 현미경 (Single molecular localization microscopy, SMLM)

역시 2014년 노벨 화학상을 수상한 형광 광학현미경의 한 종류. 단일 형광 분자로부터 방출되는 형광을 취득해 얻은 무수한 이미지로부터 각각의 형광 분자의 위치를 계산하여 초고해상도 이미지를 재구성하는 현미경. 와이드 필드(Widefield) 기반 현미경이다. 

6.광각(Widefield) 이미징

대물렌즈의 회절 한계에 해당하는 해상도로 취득된, 넓은 영역을 카메라로 한번에 취득한 이미지. 스캐닝 기반 현미경보다 시간 분해능이 좋다. 

 7.평면파(Plane wave)

넓은 영역을 한꺼번에 취득할 수 있는 파형. 이 실험에서 진폭의 변화를 없애면 평면파가 된다. 

8.정현파(Sine wave)

어둡고 밝은 부분이 존재하는 줄무늬 빛. 어둡고 밝음의 경계가 뚜렷하지 않고 사인함수와 같이 부드럽게 이어져 있다.

[붙임] 그림설명

그림 1. 한 장의 이미지 내에서 시·공간 분해능의 선택적인 강화가 가능한 Tunable SIM의 시뮬레이션 결과. 미세 구조를 가진 세포와 빠르게 움직이는 형광 비드(알갱이)를 포함한 유체의 시뮬레이션 모델. (a) 일반 와이드 필드(wide field) 이미징의 경우 유체의 흐름을 형광 비드를 이용해 간접적으로 관찰할 수 있으나 세포의 미세구조는 흐릿하게 보임. (b) 반면 SIM의 경우 세포의 미세 구조가 또렷이 보이나, 시간 분해능이 낮아 각각의 형광 비드의 이미징이 불가능함. (c) 개발된 현미경(Tunable SIM)은 유체의 흐름(형광비드의 움직임)과 초고해상도로 세포의 미세구조 변화를 동시에 관찰 가능함.

그림 2. Tunable SIM 현미경의 작동 모식도. 조사하는 빛의 진폭을 공간적으로 다르게 제어하여, 미세 구조를 관찰하고 싶은 영역에 한해서 정현파 패턴을, 나머지 영역에 대해서 평면파를 조사하게 되면, 한 이미지 내에서 시공간 분해능을 선택적으로 강화할 수 있게 된다.

그림 3. 미세 유로 채널 내에 배양된 세포와 주변을 흐르는 유체 흐름의 삼차원 분포. (a) SIM 이미지 획득을 위해 정현파 패턴을 세포에만 조사하고 나머지 영역에 서 빠른 속도로 흐르고 있는 형광 비드를 측정한 결과. (b) 형광 비드의 위치와 속도를 추출한 결과. (c) 형광 비드의 위치와 속도를 바탕으로 재구성한 유체 흐름의 3차원 분포.

그림 4. 세포의 미세 구조 변화의 초고해상도 이미지. (a)초고해상도 (SIM)와 일반 해상도 (widefield)로 표현된 세포와 주변의 유체 흐름 매핑 결과(빨간 화살표)와 노란 선 내부를 확대한 결과(b,c). 초고해상도로 관찰한 유체의 흐름으로 생긴 세포의 구조적인 변화(d,e).