^*산란: 매질(빛이 통과하는 물질) 굴절률 차이 때문에 빛이 진행방향이 달라지는 현상. 빛이 만나는 입자의 크기와 파장에서 따라 산란 종류가 달라진다. 생체 내 조직인 세포는 그 크기가 가시광선 파장보다 훨씬 커 빛이 산란되더라도 원래 빛의 진행 방향으로 산란된다.

^*파면(wave front, 波面): 빛은 입자인 동시에 파동의 성질을 지니고 있는데, 파동의 위상(골 또는 마루 등)이 같은 지점을 이으면 파면을 얻는다. 파면 위상(모양)이나 세기를 조절해 빛을 원하는 방향으로 이동시키는 기술을 파면 왜곡 제어 기술이라 한다. 파면 왜곡 제어기술은 빛이 한 초점에 모일 수 있도록 왜곡된 파면을 상쇄 하는 복잡한 파면을 새로 만드는 기술이다.

[붙임] 연구결과 개요

1. 연구배경

우리는 흔히 일상 속에서 레이저나 손전등 등을 벽이나 혹은 자신의 손에 쏴 봤을 때 반대편으로 빛이 곧바로 통과하는 것이 아닌 뿌옇게 연해지며 퍼지는 것을 볼 수 있다. 이는 빛이 물체를 투과할 때 물체를 이루는 구성성분의 굴절률 분포와 그 두께에 따라 여러 방향으로 산란하게 되기 때문이다. 이때 빛이 진행하며 마주치는 굴절률이 다른 입자들에 의해서 산란된 빛은 서로 불규칙하게 간섭하여 스페클 패턴(speckle pattern)1)을 만들게 된다. 만약 벽너머에 우리가 보고 싶은 물체가 있다면 물체에 빛에 도달하기도 전에 그 분포가 무작위적으로 변하기 때문에 벽너머 물체를 볼 수 없는 것이다.

이러한 상황에서 바이오 이미징에서는 1900년대 초 특정 파장대의 빛만을 방출 하는 형광물질로 염색된 물체를 사용하여 원하는 목표에서 나오는 신호만을 관찰할 수 있는 형광 현미경 (Fluorescent microscope)2) 기술들이 개발 되었다. 그러나 앞서 설명한 산란 문제로 물체가 두꺼워 질수록 물체에 도달하는 빛의 세기가 기하급수적으로 줄어들어 결국 염색된 물체에서 나오는 형광신호 마저 측정이 어렵게 되었고 이를 해결하기 위해서는 빛의 세기 자체를 강하게 하거나 가시광선 보다 산란이 적은 긴 파장대의 빛을 사용하여야 했다.

하지만 빛의 세기가 증가하면 그 자체로 세포에 손상을 가할 수 있고 형광 물질에서 나오는 빛이 약해지는 광 퇴색 (Photobleaching)3) 현상을 가속화 하게 된다. 또한 긴 파장 대의 빛을 사용하여 얻을 수 있는 공간 분해능의 한계(회절 한계 Diffraction limit)4)는 가시광선 보다 떨어졌기 때문에 완전한 해결책은 아니었다.

이 문제를 해결하기 위해 기존의 산란되는 빛 자체를 제어 할 수 있는 파면 왜곡제어(Wavefront shaping)5) 기술이 등장하게 된다. 빛 자체를 제어하여 생물 조직 내의 세포나 단백질, 지질 등에 의해 왜곡된 빛 마저도 한 지점으로 모아 활용 할 수 있게 된 것이다. 하지만 빛의 파면을 제어하여 최적을 파면을 얻기 위해선 반복적으로 긴 시간 조직에 입사하는 파면을 바꾸면서 그 결과를 측정하여야 하는데, 이번 연구에선 이런 생체 조직에서 파면 왜곡제어 기술을 사용할 때 동 시간 대비 더 높은 효율을 얻을 수 있는 새로운 방법을 제시하였다.

2. 연구내용  

일반적으로 빛이 생체 조직을 투과할 때에는 100μm 두께를 넘어서면 산란을 시작하고 1mm 두께를 넘어서면 빛이 진행하는 방향에 대한 상관성을 완전히 잃어버려 처음에 들어온 방향과 상관없이 모든 방향으로 무작위하게 진행하게 된다. 허나 생체 조직의 경우 1mm 두께 내에선 산란된 빛이라도 입사한 방향에 따라 어느 정도 방향성을 가지고 있다. 대부분의 빛의 산란 방향을 나타내는 지표로서 비등방향성 교정인자 g (Anisotropy factor g)6)를 사용하는데 생물 조직은 이 값이 0.9에 가깝다. 교정인자 g 값이 1에 근사 할수록 대부분의 빛은 진행해온 방향으로 산란하게 되고 0 에 근사 할수록 모든 방향으로 무작위하게 산란하게 된다. 생물 조직 내에서 산란을 일으키는 세포의 크기가 일반적인 빛의 가시광선 대 파장 400~700nm 보다 훨씬 큰 수 μm 이상의 크기를 가지기 때문에 이러한 현상이 나타난다.

본 연구에선 이처럼 빛이 생체 조직을 투과 할 때 일정 두께 내에선 대부분 진행 방향을 유지한다는 위와 같은 현상에서 착안해 렌즈를 통과하여 상대적으로 높은 각도에서 조직에 입사하는 빛보다 낮은 각도에서 입사하는 빛이 조직 내에서 더 적은 거리를 여행하게 되므로 이러한 빛의 파면의 왜곡만을 제어하는 것이 동일한 시간대비 훨씬 효율적이라는 것을 발견했다.

상대적으로 적은 거리를 여행한 빛의 세기 역시 먼 거리를 여행한 빛보다 산란을 덜 겪게 되고 직선에 가깝게 여행을 해왔으므로 더 강한 세기를 유지하는 것이다. 두 명의 선수가 장애물 경주를 한다고 생각해 보면, 한명은 목표지점까지 곧장 직진거리로 주파하고 다른 한명은 목표지점에서 45도 틀어져 있는 거리의 출발선에서 목표를 향해 달린다고 할 때 동일한 속도로 달릴시 당연히 직선거리로 달린 선수가 빨리 들어오고 힘도 덜 들 것이다. 이는 빛이 생물 조직을 통과할 때도 마찬가지이다. 먼 거리를 여행한 빛은 여행도중 세포나 다른 장애물을 만날 때마다 산란을 하고 광자(빛입자)를 잃어버리며 진향 방향마저 일정하지 못할 것이다.

연구팀은 실제로 710μm 두께의 쥐 뇌 조직을 투과하여 형광비드를 이미징 할 때 조직에 입사하는 빛의 개구수 (Numerical aperture)7)를 0.33에서 0.15 로 줄여 선택적 영역만 파면제어 함으로써, 동일한 파면왜곡제어 시간에 비해 형광신호의 세기는 8.9배, 형광비드와 주변 배경간 신호의 대비는 2.1 배나 상승하는 효과를 얻을 수 있었다. 또한 보통의 광학 현미경에서 렌즈의 개구수가 줄면 해상도가 감소하는 것과 다르게 본 연구에서는 해상도 역시 거의 유사한 수준으로 유지해 효율을 증가시킬 수 있었다.

3. 기대효과

기존의 파면왜곡 제어 시스템에선 빛이 투과하는 매질과 상관없이 입사하는 빛의 개구수를 모두 사용 및 제어하는 것이 일반적이었다. 이번 연구에선 입사하는 빛의 개구수를 줄여 해당면적을 간단히 제어하는 것만으로 동일한 시간 안에 이미지의 해상도는 거의 유지하면서 월등히 뛰어난 신호 세기와 이미지 대비를 얻을 수 있다는 것을 처음으로 증명하였다. 생물조직과 같이 높은 비등방향성 교정인자 값을 가지는 매질이 한하여 빛의 진행방향에 대한 상관성을 완전히 잃어버리는 두께인 1mm미만일 경우 이와 같은 가설이 성립한다.

새로 개발된 기술의 높은 형광 신호세기를 바탕으로 기존에는 신호가 너무 미약하여 관찰이 불가능 하였던 두께의 생체샘플에서도 가시광선을 사용해 이미지를 얻는 것이 가능해졌다. 또 동시에 이 기술은 기존에 빛을 이용한 광선치료법 (Phototherapy)8) 및 광유전학 (Optogenetics)9) 과 같이 조직내부에 전달되는 빛의 에너지에 기반 한 기술 등으로 확장될 수 있다.

[붙임] 용어설명

1. 스페클 패턴 (Speckle pattern)

레이저와 같이 서로 다른 두 위치에서 동일한 파면을 가지고 시간에 따라 주파수가 변하지 않는 빛이 굴절률이 다른 물체를 만나 산란되는 빛들끼리 서로 달라진 위상차이로 인해 생기는 불규칙한 간섭무늬이다. 간섭무늬의 반점의 평균 크기는 관측하는 광학계의 개구수에 의해 결정된다.

2. 형광 현미경 (Fluorescent microscope)

세포와 같이 투명한 물체를 보기 위해 또는 조직 내에 원하는 세포만을 관찰하기 위해 스스로 특정 파장대의 빛을 흡수하고 흡수한 빛보다 더 긴 파장대의 빛을 방출하는 형광물질을 사용하여 염색한 물체를 볼 수 있게 구현한 현미경이다. 이를 관찰하기 위해서 특정 파장만 통과 가능한 필터를 부착하여 특정 형광신호만을 관찰할 수 있는 현미경을 형광 현미경이라 칭한다. 

3. 광 퇴색 (Photobleaching)

특정파장대의 빛을 방출하는 형광물질이 장시간 혹은 단시간 강한 빛에 노출되어 빛 에너지에 의하여 화학구조의 결합이 끊어지게 되면 불가역적으로 물질의 화학구조가 변성돼 방출하는 특정파장대의 빛의 세기가 약해지는 현상. 

4. 회절 한계 (Diffraction limit)

현미경 관찰 기술에서 공간분해능(얼마 짧은 거리를 식별할 수 있는지)를 나타내는 값. 회절 한계 값이 작을수록 공간분해능(해상도)가 높은 이미지를 얻는다. 독일의 물리학자 Ernst Abbe 가 제안한 회절한계 이론에 따르면 회절한계는 사용한 빛의 파장 길이를 개구수의 두 배 곱으로 나눈 것으로 결정된다. 따라서 파장의 길이가 짧은 빛을 쓰고 개구수가 큰 렌즈를 쓸수록 해상도가 높아진다. 

5. 파면 왜곡제어 (Wavefront shaping)

적응광학(adaptive optics ; AO) 의 일종으로 빛의 파동이 진행할 때 위상(골, 마루 등)이 같은 지점을 연결한 공간상의 면을 ‘파면(wave front, 波面)’이라 부르는데 이러한 파면의 왜곡을 측정하여 왜곡된 파면을 상쇄시키는 기술이다. 가변형 거울(deformable mirror) 이나 공간광변조기(spatial light modulator)를 사용한다. 또한 더 나아가 임의로 원하는 복잡한 모양의 파면 모양을 만들어 내거나 목표로 하는 위치에 보강 혹은 상쇄 간섭을 일으키는 파면의 모양을 만들어 낼 수도 있다.

6. 비등방향성 교정인자 g (Anisotropy factor g)

빛이 진행도중 굴절률이 다른 입자를 만나 산란하게 되는 모든 각도의 코사인 값의 앙상블 평균값. 산란각도의 대부분이 0도에 가까울수록 코사인 값은 1에 근사하게 된다. 이는 빛은 산란 후에도 진행방향을 거의 벗어나지 않고 직진함을 의미한다. 빛이 모든 방향으로 산란하게 되면, 산란각도가 모든 각도에서 고르게 분포해 코사인 값의 평균은 0에 근사하게 된다.

7. 개구수 (Numerical aperture)

렌즈의 공간 분해능(해상도)을 계산하기 위한 지표로, 개구수가 클수록 높은 해상도의 이미지를 취득할 수 있다. 개구수는 측정 대상으로부터 대물렌즈에 입사하는 빛의 광축을 기준으로 대물렌즈로 입사 가능한 빛의 최대 각도의 사인 값과, 측정 대상과 대물렌즈 사이의 매질의 굴절률의 곱으로 정의 된다. 이번 실험에서는 렌즈 자체를 바꾸지 않고 조리개를 이용해 대물렌즈를 통과하는 빛의 가장자리를 부분을 제거함으로써 개구수를 줄였다

8. 광선치료법 (Phototherapy)

대표적으로 레이저를 사용한 피부질환 치료가 이에 해당한다. 광자가 가지는 에너지를 사용하여 몸 내부 혹은 표면에 있는 종양을 제거하거나 바이러스나 세균 등을 제거하기 위해서도 사용된다. 

9. 광유전학 (Optogenetics)

특정 파장을 가진 빛에 반응하여 생물의 유전적인 변화를 일으키는 기술을 의미한다. 대부분의 일반적인 세포는 빛에 반응하지 못함으로 빛에 반응 하여 단백질 구조상에 변화를 일으키는 유전자를 가진 바이러스를 목표로 하는 생물체에 침투시켜 목표 생물체에 전이시킴으로써 빛에 의해 원하는 반응을 일으키게 설계한다. 예를 들어 빛에 반응 하여 계폐가 조절되는 이온 채널 (ion channel)을 세포나 생물체에 발현시킨 후 세포 및 조직을 활성화 시켜 관찰하는 방법이 있다.

10, 평면파(Plane wave)

빛의 파면이 직선 또는 평면인 파로 평면을 이루는 공간상 모든 좌표에서 모두 같은 위상 값과 세기 값을 가진다.

[붙임] 그림설명

그림 1. 효율적인 파면왜곡 제어와 기존 파면왜곡제어 방법의 비교 설명.

(좌단) 파면왜곡제어 없이 일반적인 평면파(Plane wave)10)를 렌즈를 통과하여 조직에 입사시키게 된다면 하나의 초점으로 모이지 못하고 모두 산란되어 스페클 패턴을 만든다. (중앙) 기존의 파면왜곡제어 방식은 입사하는 빛의 파면의 개구수를 모두 사용하여 발생하는 왜곡을 제어하는 방식이다. (우단) 본 논문에서는 동일한 빛의 세기를 사용했을 때 입사하는 빛의 파면의 개구수를 줄여 파면왜곡제어에 사용하는 것만으로 동일한 파면왜곡 제어 시간을 사용하여 기존 방식대비 높은 세기의 초점을 만들어 낼 수 있다는 것을 처음으로 선보였다.

그림 2. 효율적인 파면왜곡 제어 실험 모식도.

생물조직에 의한 산란 왜곡을 상쇄시키는 파면을 생체조직에 조사함으로써 파면왜곡제어를 구현한다. 조절 가능한 조리개를 부착해 개구수 줄여 기존의 파면개구수를 모두 사용하는 방식과 달리 효율적이다.

그림 3. 710μm 두께의 쥐 뇌 조직을 통과한 형광 비드 이미징 과 신호세기 선 그래프. 고정시킨 쥐 뇌 조직을 투과하여 조직 뒤에 있는 형광비드를 파면 왜곡제어를 통해 이미징한 결과. 입사하는 파면의 개구수가 (c) 0.33 일 때 보다 (b) 0.22 에서 (a) 0.15 로 줄면 이미지의 세기와 대비가 동시에 상승한다. (e) 각 이미지의 노란색 점선 부분을 따라 형광 세기를 선 그래프로 나타내었다. 이때 점선은 각 선 그래프의 최대 세기로 정규화한 그래프를 의미한다. 개구수를 0.15로 줄여서 파면 왜곡제어를 통해 이미징 했음에도 불구하고 산란매질 없이 개구수를 모두 사용한 이미지(d) 보다 뛰어난 해상도의 이미지를 얻을 수 있음을 보여준다(f).

그림 4. 효율적인 파면왜곡 제어를 적용한 쥐 뇌 속 신경세포 이미징.

실제 효율적인 파면 왜곡제어로 쥐 뇌 속 신경세포를 이미징 했을 때 보이는 차이. (a) 조직에 의한 왜곡이 아니라 광학계 시스템에 의한 자체적인 왜곡만 보정해준 파면을 입사해 세포를 이미징한 결과(상단)와 파면 왜곡을 상쇄 시키는 파면지도(하단). (b) 조직에 입사하는 개구수를 0.3 으로 사용하여 파면왜곡제어를 통해 얻은 세포 이미지와 파면지도. 아직까지 세포에서 나오는 신호가 배경 노이즈에 묻혀 신경세포가 잘 구분되지 못한다. (c) 조직에 입사하는 개구수를 0.15 로 줄여 파면왜곡 제어를 실행 하였을 때 얻어지는 이미지와 파면지도로 (b) 와 달리 세포에서 나오는 신호세기가 월등하게 증가하여 배경 대비 세포를 확실하게 분간할 수 있게 되었다.