1. 연구배경

TRAIL1)은 암세포에 발현 된 사멸수용체(death receptor)2)에 특이적으로 결합하여 암세포만 골라 죽이는 단백질로 알려져 있다. TRAIL이 처음 발견 된 이후로부터 이 원리를 항암제로 응용하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 하지만 TRAIL은 낮은 안정성을 가지고, 사멸수용체와 결합친화성이 약해 생체 내에서의 효과가 매우 떨어진다는 단점 있다. 또 TRAIL에 대하여 내성을 가진 암세포가 많기 때문에 이런 점들을 극복할 수 있는 효과적인 플랫폼 개발이 필요하다. 따라서 본 연구팀은 단백질 나노 입자를 이용해 암세포에 효과적으로 TRAIL을 전달하여 강하게 암세포 사멸을 유도하는 플랫폼을 개발하였으며 이를 세포와 마우스 모델에서 입증하였다.

2. 연구내용

암세포만 골라죽이는 TRAIL의 효과를 극대화 시키고 앞선 연구들에서 가지고 있는 단점을 극복하기 위하여 본 연구팀은 암세포에 발현된 사멸수용체와 EGF수용체3)를 동시에 표적하는 듀얼 리간드 표지 플랫폼을 개발하였다. 리간드는 특정 수용체 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 말한다.

이 플랫폼은 총 3개의 단백질로 구성되어 있다. 구형의 AaLS 단백질 입자에 EGF수용체 표적 리간드인 EGFR affibody(EGFRAfb)4)와 사멸수용체를 표적으로하는 TRAIL이 각각 고정된 형태다. 다양한 암에서 EGF수용체가 과발현되는 현상에 주목해 이 같은 약물전달 플랫폼을 개발했다.

EGF수용체 표적 리간드인 EGFRAfb는 EGF수용체에 강하게 결합할 수 있어 ‘듀얼 리간드 표지 단백질 나노입자’5)(AaLS/TRAIL/EGFRAfb)를 암세포로 효과적으로 전달 할 수 있다. 또 TRAIL과 사멸수용체의 결합 빈도를 늘리고 암세포의 약물 내성의 원인이 되는 EGFR 신호 전달 체계를 저지하는 역할을 해 TRAIL의 효능을 극대화 할 것으로 예상하고, 이 같은 약물전달 플랫폼을 설계했다.

이러한 플랫폼은 단백질 간의 결합이 간단하게 이루어 질 수 있는 특수시스템인 SpyTag/SpyCatcher6)을 통하여 만들어졌다. 이 시스템은 단백질 작용에 중요한 모양 변화 없이 이러한 결합을 유도할 수 있다. 단백질 나노입자에는 SpyTag 가 연결 되어 있고, 이용 할 리간드들에는 SpyCatcher가 연결되어 있어 간단히 섞어주기만 하면 빠르게 단백질 나노입자에 여러 리간드들을 표지 시킬 수 있게 된다.

TRAIL과 EGFRAfb를 동시에 표지하는 ‘듀얼 리간드 표지 단백질 나노 입자’는 EGFR 과발현 암세포주인 A431(피부암 세포)에 큰 독성을 나타내었으며, EGFR이 과발현 되지 않은 T47D(유방암 세포)와 HEK293T(정상 신장 세포)에서는 그러한 효과를 보이지 않는 것을 확인하여 EGFR 과발현 암세포에만 적용 가능한 치료 플랫폼임을 확인하였다.

뿐만 아니라 듀얼 리간드 표지 단백질 나노 입자가 EGF(세포재생인자)에 의한 EGFR 신호 전달 체계를 저지함에 따라서 내적·외적세포사멸 시그널을 동시에 크게 활성화 시키게 되고 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다는 사실을 분자 단위에서 규명하였다.

연구팀이 A431 암세포 종양 마우스 모델을 만들어 단백질 나노 입자에 형광물질을 달아 암세포에 선택적 전달 효능을 비교한 결과 EGFRAfb가 있는 나노입자의 경우에만 높은 형광을 가지는 것을 확인하였다.

마지막으로 듀얼 리간드 표지 단백질 나노 입자를 혈관을 통해 주사한 마우스에서만 대조군과 다르게 종양 성장을 크게 억제 할 수 있는 것을 확인함에 따라 EGFR 과발현 종양에 대한 듀얼 리간드 표지 단백질 나노 입자의 탁월한 항암 효능을 확인하였다.

3. 기대효과

이번 연구를 통해 암세포 특이적으로 세포사멸을 유도하는 단백질인 TRAIL을 EGFR 과발현 암세포에 효과적으로 전달할 수 있는 듀얼 리간드 표지 단백질 나노 입자를 개발하였고 이 플랫폼이 여러 EGFR 과발현 암세포를 치료 할 수 있는 효과적인 단백질 기반 치료제로 사용될 수 있을 것이라 생각된다. 뿐만 아니라, 향후 여러 단백질 기반 리간드 또는 신호 조절인자들을 운반하기 위한 새로운 치료 플랫폼 개발에 단백질 나노 입자 기반 플랫폼이 효과적으로 이용이 될 수 있을 것으로 기대 된다.

[붙임] 용어설명

1.TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)

종양괴사인자 연관 세포사멸유도 리간드인 TRAIL 은 TNF superfamily 리간드 중 하나로 death receptor(사멸수용체) 에 결합하여 세포사멸을 유도한다. TRAIL은 사망 수용체를 과발현하는 암세포의 세포사멸을 선택적으로 유도할 수 있어 유망한 생물학적 항암제로 인정받고 있다.

2.수용체(Receptor)

수용체는 세포 표면이나 안에 있는 단백질 분자로, 다른 세포에서 분비되는 생화학적 신호(리간드 단백질, 이온, 호르몬 등)를 받아, 이를 세포 내부로 전달하는 역할을 한다.

3.EGFR (Epidermal growth factor receptor –표피 성장 인자 수용체)

수용체 티로신 키나아제 패밀리의 구성원인 EGFR은 암세포의 성장, 전이, 부착 및 생존을 조절하는 복잡한 신호 전달 경로에 관여하고, 유방암, 폐암, 뇌암을 포함한 여러 유형의 암에서 빈번하게 과발현 된다. EGFR의 비정상적인 활성은 암세포의 생존과 증식과 관련이 있다고 알려져 있다.

4.어피바디(Affibody)

특정 표적 물질에 특이적으로 결합하는 인공 단백질로 기존에 많이 알려진 항체보다 작지만 강한 결합력을 가진다는 특성이 있다. 본 연구에서는 EGFR에 특이적으로 결합하는 EGFR Affibody를 이용하였다.

5.단백질 나노 입자 (Protein nanoparticle)

나노크기(100nm 이하)의 입자형태 물질로 특히 균일한 크기와 구성, 생분해성 및 유전적 변형에 대한 높은 순응성을 가진다는 장점이 있다. 본 연구에서 사용된 단백질 나노 입자는 lumazine synthase(AaLS) 나노입자로 60개의 서브유닛으로 이루어져 있다.

6. SpyTag/SpyCatcher

13개의 아미노산으로 이루어진 SpyTag 펩타이드와 15kDa SpyCatcher 단백질은 용액 상에서 단순히 섞어주었을 때 공유 결합을 자발적으로 형성하도록 개발된 분할 단백질이다. Genetic-fusion을 통해 원하는 단백질에 기능적 변화를 주지 않고 결합 할 수 있다. 본 연구에서는 TRAIL 과 EGFR Affibody를 각각 SC에 연결하고(SC-TRAIL & SC-EGFRAfb), 단백질 나노입자에 ST을 연결하여(AaLS-ST) TRAIL과 EGFR Affibody를 동시에 표지하는 단백질 나노입자를 만들었다(AaLS/TRAIL/EGFRAfb).

[붙임] 연구결과 개요, 용어설명

그림1. 단백질 나노 복합체의 작용 원리. TRAIL 단백질의 암세포 사멸수용체와 결합해 암세포 자살(apotosis)를 유도하며, EGF수용체에 결합한 EGFR어피바디(EGFR Affibody)는 EGFR신호 전달 경로를 차단해 TRAIL의 효과를 극대화한다.

그림 2. 단백질 나노 복합체의 효능을 동물 실험을 통해 확인함

(A) 마우스의 종양 크기 그래프를 통해 대조군과 비교하여 개발한 복합체(AaLS/TRAIL/EGFRAfb)가 가장 효과적으로 종양 억제를 할 수 있는 것을 확인함.

(B) 실험 군들 간의 실제 종양 크기 비교 사진.

(C) 쥐의 몸무게 변화가 크게 없는 것을 통해 단백질 나노 입자의 안정성을 확인함.

그림 3. 단백질 나노 복합체의 암세포 특이적 세포사멸 유도를 세포 단위에서 확인함

(A) 저농도의 개발한 단백질 나노 복합체가 EGFR을 과발현하는 A431 암세포를 효과적으로 사멸할 수 있음을 확인함

(B) 단백질 나노 복합체가 효과적으로 EGFR 과발현 암세포의 사멸을 유도 할 수 있는 것을 여러 세포사멸유도 인자를 검출하는 실험을 통해 입증함.