[붙임] 연구결과 개요

1. 연구배경

기존 세포 배양과 이식을 위한 3차원 지지체는 대부분 콜라젠, 피부로넥틴, 메트리젤 등으로 동물 유래인 경우가 대부분이었다. 환자 치료를 위한 3차원 세포 지지체는 돼지유래 조직에서 dECM을 사용하는 경우가 있었으나 면역거부반응이나 혈관 구조체 부재 등의 잠재적 문제점이 있어왔다. 자가혈장을 주사하여 치료하는 방법은 임상적 사용되고 있지만 조직재생을 유도하는 물질을 자가유래 혈장으로 주사한다는 장점이 있지만 혈관화된 구조체를 직접 이식하는 치료가 아니라서 효과적인 대면적 조직 재생에는 적용이 어려웠다.

성인 몸에 5리터 정도를 차지하는 혈액은 다양한 섬유 단백질을 포함하고 있는 자가유래 생체재료의 자원이지만 겔화 (gelation)이 되었을 때 혈소판에 의해 혈전이 수축이 되고 섬유 단백질들이 불규칙적으로 형성되어 세포 배양과 분화에 적합하지 않은 미세환경을 제공한다는 문제점이 있어왔다. 이번 연구는 이러한 문제점을 해결함으로써 자가유래 혈액을 3차원 세포 지지체로 활용할수 있을 뿐아니라 세포 배양 및 분화에 적합한 미세환경을 제공하여 재현성있고 신뢰성 있는 이식 구조체를 체외에서 제작할 수 있다는 것을 처음으로 보고한 것이 의미를 갖는다.

일반적으로 상처는 보통 치료를 통해 또는 자연적으로 치유가 된다. 그러나 혈관을 비롯한 전층 피부 손상(Full thickness wound)이 발생한 경우, 내외부적 요인에 의해 상처가 낫지 않고 악화되기를 반복하며 이러한 상처를 “만성 창상 (cutaneous wound)”이라고 한다. 최근 전 세계적으로 고령화가 진행되면서, 노화에 의한 당뇨병, 혈압, 혈관 질환 등의 증가로 인해 합병증으로 만성 창상 발생이 증가하고 있다.

만성 창상을 치료하기 위해서는, 습윤 환경 조성, 고압 산소 치료, 약물 치료 등 간접적인 치료 방법들이 시도되고 있지만, 이들은 치료 효과가 미비하다. 따라서 심각한 상처의 경우, 손상된 부위에 직접적으로 피부 조직을 이식하는 방법이 적용된다. 그러나 감염 및 면역 거부 반응에 의한 이식 조직의 괴사 발생위험이 높고, 재생 후 큰 흉터를 남기게 되어 환자의 삶의 질을 떨어뜨린다.

만성 창상의 악화 및 치료 효과 저하의 가장 큰 요인 중 하나는 혈관 소실로 인한 혈액 순환 부족이다. 상처 주변 조직으로부터 치유와 감염 대응에 필요한 산소, 면역 세포, 영양소 공급이 원활하지 않기 때문에 치유가 더디게 진행된다. 혈관이 재생성되지 않는 상처에는 이식 치료를 시도하더라도 괴사로 이어져 치료 효과를 떨어뜨린다. 따라서 창상 치료를 촉진시키기 위해서는 상처 부위의 혈관조직 재생성이 우선적으로 필요하다.

이러한 이유로, 최근 혈관 내피 세포가 배양되어 있거나 혈관 형성을 촉진하는 물질이 포함된 인공 조직을 상처 부위에 이식하는 시도가 이루어지고 있다. 하지만 현재 개발된 인공 조직을 구성하는 "지지체(scaffold)"의 재료가 이종유래 또는 화학적 합성 물질로 제작되어 면역 거부 반응의 위험이 높다. 또한 지지체 가공 기술의 한계로 인해 실제 조직의 미세 환경 구조 및 강성을 재현하지 못하여 이식 후에도 상처 부위의 혈관 생성 효과가 저하된다. 따라서 새로운 재료와 가공 방식을 적용한 이식용 혈관 조직체 개발이 필요한 상황이다.

2. 연구내용

“혈액(blood)”을 미세유체기술을 통해 가공하여 혈관 생성을 유도할 수 있는 지지체로 제작하고, 해당 지지체에 모세혈관을 배양하여 상처에 이식함으로써 상처 재생 효과를 검증하였다. 혈액 내에는 섬유(fiber)를 생성할 수 있는 다양한 단백질들이 존재한다. 우리가 익히 알고 있는 혈전(thrombi) 또한 혈액 안의 피브리노겐이라는 단백질이 피브린 파이버(fibrin fiber)로 섬유화되면서 액체였던 혈액이 젤 형태의 혈전이 되는 것이다. 일반적인 혈전은 피브린 섬유가 방향성 없이 엉켜있고, 혈소판에 의해 수축이 심하게 일어나고 강성이 높아져, 인공조직을 제작하기 위한 지지체로써 적합하지 않다.

우리는 미세유체 시스템(microfluidic system)을 통해 혈액을 빠르게 흘림으로써 발생 되는 전단응력(shear stress)에 의한 혈전 생성을 유도하여 일반적인 혈전과는 달리 지지체로써 적합한 특성을 가지게 했다 (그림 1). 전단응력은 피브린 파이버 번들(bundle)을 형성하여 기계적 특성이 강화되기 때문에 혈소판에 의한 혈전의 수축을 막아서, 결과적으로 형태를 유지 시킬 뿐만 아니라 내피세포의 혈관화에 적합한 기계적 강성(stiffness)을 제공하게 된다. 동시에 전단응력은 피브린 파이버를 혈액이 흐르는 방향으로 정렬시키고 혈소판을 활성화하여, 기계적 및 화학적으로 최적의 미세환경을 제공하여 배양하는 내피세포의 성숙과 혈관화를 촉진한다.

미세 유체 기술로 엔지니어링 된 혈전에 내피세포를 배양하였을 때, 기저막(basement membrane) 단백질이 잘 발현되는 관 형태의 혈관으로 발달이 촉진되는 것을 확인하였다 (그림 2). 이는 실제 인체의 모세혈관의 기능을 할 수 있는 성숙한 혈관을 형성함을 의미한다. 이 기술로 제작한 이식용의 혈관이 형성된 혈전, 즉 implantable vascularized engineered thrombi (IVET)를 동물모델(mice and rat, 쥐의 일종)에 이식하여서 상처 부위의 혈관 네트워크를 재생성하고, 주변 혈관과 문합함으로써 회복에 필요한 물질들을 빠르게 전달하여 상처 회복을 촉진할 수 있음을 확인하였다.

전층 피부 손상을 만성 창상으로 발전시키는 심각한 원인 중 하나가 “감염”이다. 이 연구를 통해 IVET 이식이 감염이 발생한 상황에서도 회복을 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다 (그림 3). 우리는 항생제 내성을 가진 박테리아 중 하나인, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)를 전층 피부 손상 된 상처에 감염시킨 상태에서 실험을 진행하였다. IVET 가 이식된 상처에서는, 빠르게 회복된 모세혈관 네트워크를 통해서 박테리아에 대응할 수 있는 혈액 내 단백질들과 면역 세포(immune cell)가 활발히 이동됨을 확인할 수 있다, 특히 박테리아를 공격할 수 있는 호중구(neutrophil)가 회복된 혈관을 통해 빠르게 다량 이동하여 감염에 대응하는 것을 확인하였다. 이어서 상처 회복을 촉진시키는 M2 표현형의 대식세포(M2-type macrophage)의 상처부위로의 이동을 통해 상처 치유를 가속화하였다. 결과적으로, IVET의 이식은 표피 두께, 콜라겐 형성, 모 낭 개수 등을 개선 시켜 흉터 없는 상처 회복을 촉진 시킴을 검증하였다.

3. 기대효과

이번 연구에서 개발한 IVET는 “혈액”을 재료로 사용하기 때문에 창상 환자 본인의 혈액을 뽑아서 제작하여 본인의 상처에 이식할 수 있다는 큰 장점이 있다. 이는 인공조직의 면역거부반응 문제를 완전히 해결할 수 있어서 안정성과 치료 효과를 크게 개선할 수 있다. 실제로 해당 논문에서는, 인간 혈액으로 제작한 IVET 뿐만 아니라, rat의 자가혈액으로 IVET를 제작하여 상처에 이식하는 자가혈액유래 IVET 제작 및 치료효과를 검증하였다.

여러 자가유래조직 기반 재료 개발 연구들에서, 지방, 췌장, 태반 조직 등을 사용한 지지체 개발이 되어 왔으나 혈액은 환자에게 추가적인 수술 없이 필요한 만큼 여러 번 채혈을 통한 채취가 가능하다는 점에서 차후 대면적의 상처에 적용할 인공 조직 제작에 훨씬 유리하다.

또한 미세유체기술을 기반으로 제작하기 때문에, 미세유체 디바이스의 디자인에 따라서 다양한 세포에 대해 적합한 미세환경을 제작할 수 있다. 이번 연구에서 제작한 혈관 조직 뿐만 아니라, 다양한 조직의 미세환경을 모사한 혈전 지지체를 제작하여서 적용할 수 있는 이식 치료 범위를 더 넓힐 수 있을 것으로 기대된다. 마찬가지로 혈관 세포 뿐만 아니라 다른 세포와의 공배양을 통해서 혈관이 생성된 인공조직체를 제작함으로써, 이식 치료 효과를 검증할 뿐만 아니라 체외 약물 스크리닝 시스템에도 활용될 수 있을 것으로 예상한다.

[붙임] 용어설명

1. 미세유체시스템(microfluidic system)

미세 가공 기술을 이용하여 기판 상에 형성한 미소 유로(microchannel)를 형성하고 마이크로수준에서 유체의 흐름을 조절하는 장치 및 시스템.

2. 탈세포화된 세포외기질(dECM: decellularized ExtraCellular Matrix

탈세포화(decellularization)란 조직 또는 장기에서 세포를 제거하는 것을 뜻함. 생체조직은 주로 세포(cell)와 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어져 있음. 타인이나 동물 조직ˑ장기의 세포외기질을 이식재료로 사용하기 위해서 면역거부반응이 발생하지 않도록 가공처리를 할 필요가 있음. 세포 표면에 존재하는 항원에 의해 주로 면역거부반응이 발생하므로, 이를 해결하기 위해 탈세포화를 진행함.

3. 지지체(scaffold)

조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것

4. 피브리노겐(fibrinogen)

혈액 내에 있는 혈액응고인자 단백질 중 하나로, 혈액 응고에 있어서 중요한 역할을 함.

5. 번들(bundle)

꾸러미, 묶음. 여기서 피브린 파이버 번들(fibrin fiber bundle)은 피브린 파이버(fibirn fiber) 여러 개가 겹쳐 하나의 묶음 형태로 존재함을 뜻함.

[붙임] 그림설명

그림1. 미세유체기술을 통해 IVET를 제작하는 원리와 특성.

미세유체칩에 혈액을 빠르게 흘려 전단응력을 발생시키고, 이 전단응력에 의해 형성된 혈전은 내부 피브린 섬유들이 혈액의 흐름 방향으로 정렬 및 번들화 (bundle) 되어 있어서 수축 없이 혈관 생성에 적절한 기계적 특성을 가지고 있음.

그림2. IVET 내 형성된 혈관의 특성

정렬된 피브린 섬유, 적절한 강성, 활성화된 혈소판을 포함하고 있는 전단응력 기반 혈전에 혈관세포를 배양하였을 때, 내피 세포가 성숙된 모세혈관으로 발달이 촉진됨을 확인.

그림3. 박테리아 감염된 동물모델에서 자가유래 IVET 이식치료 효과.

상처가 항생제 내성 박테리아(MRSA)가 감염되더라도, IVET 이식을 한 상처에서는 혈관 재생성에 의한 호중구 이동 증가, M2 타입 대식세포 (anti-inflammatory macrophage) 증가 등을 통해 더 빠르게 상처가 회복됨을 확인함, 더 나아가, 콜라젠 생성과 모낭 수 증가 등을 통해 흉터 없이 상처를 회복시킬 수 있음을 검증함.