[붙임] 연구결과 개요

1.연구배경

이타콘산은 플라스틱, 접착제, 의약품, 화장품 등의 원료로 쓰이며, 특히 생분해 플라스틱과 의료용 소재 같은 친환경·고기능성 분야에서 수요가 증가하고 있는 바이오 기반 화학물질이다. 특히 화석연료 기반 원료의 대체와 지속 가능한 바이오화학 생산 체계 구축이라는 글로벌 요구 속에서, 아세트산과 같은 비식용 기질을 활용한 이타콘산 생합성 연구는 큰 의미를 가진다.

아세트산은 산업 공정 및 탄소포집 기술 등에서 대량으로 생산되는 저가의 탄소원으로, 경제성과 지속 가능성을 모두 갖춘 원료이다. 그러나 대장균과 같은 미생물에서 아세트산 대사는 높은 세포 독성, 낮은 환원력, 대사적 부담 등으로 인해 활용이 제한되어왔다. 이러한 문제를 해결하기 위해 기존에는 합리적 설계 기반의 대사공학 연구가 시도되어 왔으나, 균주의 생장 속도 및 생산 수율이 떨어지는 한계가 있었다.

이에 본 연구는 기존 한계를 극복하고 아세트산 기반 이타콘산 생산성을 극대화하기 위해, 바이오센서 기반의 적응 진화(Adaptive Laboratory Evolution, ALE) 접근법을 활용하였다. 이러한 진화 기반의 개량 전략을 통해 아세트산 대사 및 이타콘산 생산성을 동시에 향상시킬 수 있는 혁신적인 미생물 균주 개발이 가능할 것으로 기대되었다.

2.연구내용

본 연구는 이타콘산 생산성과 아세트산 대사 효율을 동시에 향상시키기 위해, 바이오센서 기반의 적응 진화 실험 기법을 도입하여 대장균의 한 종류인 Escherichia coli W 균주의 이타콘산 생산 최적화를 유도하는 전략을 사용하였다.

연구진은 이타콘산 농도에 따라 작동하는 바이오센서를 기반으로 한 유전자 회로를 설계했다. 이 센서는 이타콘산에 특이적으로 반응하는 전사인자와 항생제 내성 유전자(tetA)를 연결한 구조다. 전자회로의 if-then 조건문처럼 작동하는 이 회로는, if 세포 안에 이타콘산 농도가 높으면, then 전사인자가 tetA 유전자의 발현을 유도해 항생제에 저항할 수 있게 만든다. 반대로 농도가 낮으면 내성 유전자가 발현되지 않아 세균이 죽는다. 이 시스템을 테트라사이클린 항생제가 포함된 배지에 적용하면, 이타콘산을 많이 만들어내는 균주만 살아남아 고생산 균주를 자동으로 선별할 수 있다.

총 12회에 걸친 계대 배양의 과정에서 항생제 농도를 점진적으로 증가시켜 이타콘산 생산에 대한 선택압을 지속적으로 증가시켰고, 결과적으로 이타콘산 생산성과 생장속도가 모두 향상된 균주(WCS3, WCS6, WCS19, WCS23)를 얻어낼 수 있었다. 이 균주들은 초기 균주 대비 약 1.7배의 이타콘산 생산량, 1.5배의 수율, 및 1.7배의 생장속도를 보여주었다.

이러한 균주 성능 향상의 원인을 규명하기 위해 수행된 전장유전체분석(whole genome resequencing) 결과, 모든 진화 균주에서 공통적으로 약 31 kb 유전체 영역의 결실 돌연변이를 발견하였다. 이 결실 구간에는 기존에 기능이 명확히 밝혀지지 않았던 두 유전자(ecw_m2276과 ecw_m2277)가 포함되어 있었으며, 이 유전자들의 제거가 형질 향상에 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었다. 실제로 해당 유전자들을 개별 또는 동시 삭제한 실험군(WCD6, WCD7, WCD67)에서도 진화 균주와 유사한 수준의 이타콘산 생산성과 생장속도 향상이 재현되었다. 반면에 진화균주에서 해당 유전자를 과발현한 경우에서는 이타콘산 생산성과 생장속도가 크게 감소함이 확인되었다.

균주의 성능 향상 메커니즘 규명을 위해 수행한 RNA-seq 기반 전사체 분석은 균주의 대수기에서 가장 유의미한 차이를 보여주었다. 머신러닝 기반의 전사체 분석 기법인 iModulon을 활용한 분석은 진화균주에서 ppGpp 분자에 의해 유도되는 stringent response가 보다 활성화되어 전반적인 대사 조절의 재편을 보여주었다. 흥미롭게도, ppGpp는 일반적으로 생장 억제와 연관된 것으로 알려져 있기에, ppGpp 반응이 이 연구에서는 오히려 생장 촉진과 생산성 증가로 연결되었다는 점에서 주목되었다. 이러한 생장속도 증가는 균주 탄소 대사경로의 재편으로 인한 대사 효율화 때문으로 생각되었는데, 특히 ppGpp에 의해 조절받는 glyoxylate shunt 관련 유전자군(aceBAK operon)이 기존 대비 5,000% 이상 발현 증가를 보였고, 이로 인해 아세트산 대사가 더욱 효율적으로 작동하여 생장이 촉진된 것으로 해석되었다.

이를 추가로 검증하기 위해 ppGpp 생합성 유전자인 relA를 적정 수준에서 과발현시켜 ppGpp 농도 상승을 강제로 유도하였다. 결과적으로 relA 과발현 균주는 진화 균주와 마찬가지로 증가한 생장속도 및 이타콘산 생산성을 보여주었다. 이는 ppGpp 증가가 단백질 번역 및 생장 관련 유전자 발현을 저해함에도 불구하고, 아세트산 대사경로 재편으로 인한 순이익이 더 크기 때문으로 논의되었다. 이처럼 본 연구는 유전체, 전사체 분석 및 분자생물학적 실험 기법을 통해 고효율 아세트산 대사를 위한 복합적 조절 네트워크의 재편성을 ppGpp 효과의 예외 사례로서 조명하였다.

3.기대효과

본 연구는 기존의 합리적 설계 기반 접근이 가진 한계를 뛰어넘는 통합적 바이오센서-진화공학 기반 대사 최적화 전략을 성공적으로 증명하였다는 점에서 의미가 크다. 특히, 아세트산과 같은 저가이면서 지속 가능한 비식용 기질을 효과적으로 활용한 이타콘산 생산 공정의 고도화는 산업 생명공학 분야에 즉각적인 파급력을 가질 수 있다.

또한, 일반적으로 생장 억제자로 알려진 ppGpp가 아세트산 사용 조건에서는 오히려 세포 생장 및 대사 효율을 촉진하는 방식으로 작동할 수 있음을 보여줌으로써, 기존 생리학적 개념을 넘어서는 예외 사례를 제시하였다는 데 학술적 의의가 있다. 이는 향후 ppGpp 기반 조절 네트워크를 활용한 아세트산 활용 대사공학 전략으로 활용 가능하며, 고부가가치 화학물질 생산을 위한 유전자 회로 설계 및 시스템 생물학적 접근의 기초 자료로 활용될 수 있다.

마지막으로, 이번 연구에서 확인된 ecw_m2276과 ecw_m2277의 기능은 현재까지 보고된 바 없으며, 이 유전자들이 stringent response를 음성 조절할 수 있는 새로운 조절인자일 가능성을 제시함으로써, 후속 연구를 통한 미생물 생리 조절 메커니즘의 확장에 기여할 수 있다. 이는 단순한 생산 균주 개발을 넘어서 기초 생물학과 응용 생물공학의 접점을 넓히는 기여로 볼 수 있다.

[붙임] 용어설명

1.대장균

유전자가위로 특정 유전자를 잘라내거나 바꾸지 않아도, 원하는 유전자를 플라스미드 형태로 ‘넣어주기만 해도’ 새로운 물질을 합성할 수 있는 대표적인 세균이다. 세포 구조가 단순하고 성장 속도가 빨라 실험실에서 다루기 쉽고, 유전자 조작 기술도 잘 확립돼 있어 산업용 세포공장(cell factory)으로 널리 활용된다. 실제로 바이오디젤, 바이오플라스틱 등 다양한 산업용 소재가 대장균을 통해 생산되고 있다.

2.전사인자 기반 바이오센서 (transcription factor-based biosensor)

특정 대사산물과 결합해 활성 상태가 달라지는 전사인자를 이용해, 세포 내 해당 물질의 농도에 따라 유전자 발현을 조절하는 합성생물학 도구. 본 연구에서는 이타콘산과 결합해 활성화되는 전사인자를 활용해, 이타콘산 농도가 높을수록 항생제 저항성 유전자의 발현이 증가하도록 설계됐다.

3.적응진화 (Adaptive Laboratory Evolution, ALE)

자연계의 진화를 실험실 내에서 모사하여 균주 개량에 활용하는 실험기법. 적절한 선택압 하에서 특정 표현형의 강화가 보상으로 작용하게 설계함으로써 특정 표현형의 강화를 유도하는 돌연변이의 자연선택을 통한 축적을 유도하는 전략임. 본 연구에서는 바이오센서를 이용하여 이타콘산 고생산이 항생제 저항에 유리하도록 설계하였고, 점진적으로 증가하는 항생제 선택압 하에서 균주를 반복적으로 계대 배양함으로써 이타콘산 고생산 균주를 얻을 수 있었음.

4.전장유전체 분석 (whole genome sequencing, WGS)

차세대염기분석 (NGS) 기술을 활용하여 생물의 전체 유전제 서열을 읽고 분석하는 방법. 본 연구에서는 진화균주에서의 돌연변이를 파악하기 위해 해당 기술을 활용함.

5.전사체 분석 (RNA-seq)

차세대염기서열분석 (NGS) 기술을 활용하여 생물의 특정 순간에서의 전체 mRNA를 한번에 읽어 정량적으로 분석하는 방법. 이를 통해 유전자 발현의 첫 번째 단계인 유전자 전사 양상을 포괄적으로 확인할 수 있음.

6.ppGpp (guanosine tetraphosphate)

뉴클레오사이드 (nucleoside)의 하나인 구아노신에 2개의 이인산 (diphosphate)가 붙은 형태의 물질로, 박테리아의 스트레스 상황에서 유전자 발현을 조절하여 세포의 생존력 향상에 기여하는 신호전달 물질. 일반적으로 긴축 반응(stringent response)를 일으켜 번역 (translation) 등의 하향 조절을 통해 세포의 생장속도를 감소시키는 것으로 잘 알려져 있음.

7.긴축반응 (Stringent response)

ppGpp에 의해 유도되는 박테리아의 신호 전달 기작으로 스트레스 상황에 대응하기 위해 세균의 생장속도를 낮추고 자원을 절약하는 것으로 잘 알려져 있음.

[붙임] 그림설명